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Albery, … Shweta BansalJoscha Gretzinger, Duncan Sayer, … Stephan SchiffelsScientific Reports volume 13, Articolo numero: 1523 (2023 ) Cita questo articoloNonostante la loro fondamentale importanza nell'ecologia molecolare e nella conservazione, la diversità genetica e la struttura rimangono difficili da quantificare con i metodi tradizionali di genotipizzazione.Il sequenziamento di nuova generazione offre grandi promesse, ma questo non è stato adeguatamente testato in specie altamente mobili.In questo articolo, abbiamo confrontato le analisi dei microsatelliti e del sequenziamento RAD (RAD-seq) per studiare la struttura della popolazione nel pipistrello dalle ali piegate in declino (Miniopterus schreibersii) in tutta Europa.Entrambi i marcatori hanno recuperato modelli generali di debole differenziazione a livello di gamma, scarsa dispersione basata sul sesso e forte isolamento per distanza che si associava a una significativa struttura genetica tra le tre penisole mediterranee, che avrebbero potuto fungere da rifugio glaciale.I microsatelliti si sono dimostrati poco informativi nelle analisi basate sull'individuo, ma la risoluzione offerta dagli SNP genomici si è illuminata sulle sottostrutture regionali all'interno di diversi paesi, con colonie che condividono migratori di discendenza distinta senza mescolanza.Questa scoperta è coerente con una marcata filopatria e una partizione spaziale tra luoghi di accoppiamento e di riproduzione nella specie, sospettata da dati contrassegnati di riconquista.Il nostro studio sostiene che i dati genomici sono necessari per svelare correttamente le impronte genetiche lasciate dai processi biogeografici e dall'organizzazione sociale nei volantini a lunga distanza, che altrimenti sarebbero rapidamente offuscate dai loro alti livelli di flusso genico.Un quadro completo della struttura genetica delle popolazioni è strumentale a qualsiasi ricerca ecologica, evolutiva e di conservazione1.I modelli di variazione genetica, differenziazione e mescolanza informano sulla storia delle popolazioni e quindi aiutano a comprendere i processi ecologici e geografici che modellano la biodiversità nello spazio e nel tempo2,3,4.Le valutazioni molecolari offrono anche una rapida alternativa alle tradizionali tecniche di monitoraggio (ad es. mark-recapture), soprattutto quando si tratta di misurare i movimenti individuali, la frammentazione della popolazione e altri parametri chiave rilevanti per la conservazione come la consanguineità e l'adattamento locale5,6,7.Pertanto, le indagini genetiche sono diventate una parte essenziale della gestione delle specie minacciate8,9, assistendo la progettazione di strategie di conservazione per migliorare la connettività della popolazione10, ripristinare le popolazioni con colli di bottiglia11 e pianificare gli sforzi di traslocazione/reintroduzione rispetto alle unità evolutive12.In molti casi, tuttavia, dedurre la struttura genetica è tutt'altro che banale.I modelli di differenziazione della popolazione possono essere difficili da rilevare per gli organismi mobili, poiché le popolazioni sono omogeneizzate da episodi ricorrenti di flusso genico13,14.Il problema è anche caratteristico delle specie geneticamente impoverite che hanno sperimentato cambiamenti demografici a livello di areale, come i colli di bottiglia del rifugio e le espansioni post-glaciali, e per le quali la diversità residua potrebbe essere troppo bassa per quantificare la connettività della popolazione4.Inoltre, a volte nel ciclo di vita, raduni momentanei di individui di varie origini geografiche potrebbero anche offuscare gli apprezzamenti della diversità genetica e della differenziazione tra le popolazioni, poiché la migrazione stagionale si confonde con la dispersione15.In tali casi, un'elevata risoluzione genetica può offrire approfondimenti sugli antenati individuali che distinguono i migratori stagionali dai dispersori.In teoria, l'accuratezza delle analisi genetiche di popolazione dovrebbe dipendere dal numero di loci utilizzati rispetto alla loro variazione in piedi.I microsatelliti combinano i vantaggi dell'evoluzione neutrale16,17 e dell'esperienza di alti tassi di mutazione che generano miriadi di alleli.Di conseguenza rimangono marcatori popolari per stimare il flusso genico e la diversità tra popolazioni recentemente divergenti sin dalla fine degli anni '9018,19.Inoltre, il DNA mitocondriale altamente polimorfico (mtDNA) è più semplice ed economico da analizzare, in particolare attraverso popolazioni evolutive distanti, ed è stato di conseguenza preferito dai ricercatori interessati alla struttura filogeografica ad ampio spettro20.Tuttavia, il mtDNA deve affrontare limitazioni intrinseche rispetto alla sua natura clonale e alla modalità di ereditarietà materna, che lo rende più sensibile alla selezione21 e può influenzare la ricostruzione della storia demografica delle popolazioni, specialmente quando la dispersione è influenzata dal sesso22,23,24.Negli ultimi anni, gli ecologi molecolari beneficiano della tecnologia di sequenziamento ad alto rendimento per accedere a un numero senza precedenti di loci, preparati dalle biblioteche genomiche25,26.In particolare, il sequenziamento del DNA associato al sito di restrizione (RAD-seq27; double-digest ddRAD-seq28) è diventato un metodo diffuso per genotipizzare da centinaia a migliaia di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) in popolazioni conspecifiche o interspecifiche per applicazioni multiple, come filogeografia di risoluzione29 e studi genetici di popolazione di specie debolmente strutturate4,28.Il numero di alleli di un singolo locus microsatellite è molto più alto di quello degli SNP, ma le analisi dei microsatelliti raramente includono più di 10-20 loci a causa di vincoli pratici.Generando diverse centinaia di volte più loci, RAD-seq compensa quindi ampiamente la minore diversità per locus degli SNP per fornire inferenze genetiche di popolazione più potenti, in particolare in situazioni in cui lo scambio genico è difficile da comprendere.Tuttavia, tale miglioramento non è stato quantificato in modo soddisfacente, dal momento che i pochi studi comparativi si sono concentrati su specie con livelli relativamente forti di differenziazione della popolazione, in cui la struttura è già rilevata in modo efficiente dai microsatelliti (rivisto da 30).In questo studio, abbiamo valutato quanto RAD-seq può chiarire modelli sottili della struttura della popolazione rispetto ai microsatelliti in uno dei mammiferi diffusi sulla Terra, il pipistrello dalle ali piegate Miniopterus schreibersii.Un tempo si pensava che questa specie si estendesse dall'Europa occidentale all'Australasia, ma i cambiamenti tassonomici hanno ora ristretto il suo areale al Paleartico occidentale, dove si trova principalmente intorno al bacino del Mediterraneo (Europa meridionale, Asia minore e Nord Africa).I pipistrelli in generale sono modelli di scelta per valutare la risoluzione dei marcatori genetici.La loro elevata mobilità solitamente combinata con la filopatria femminile e la dispersione basata sul sesso31 implica un flusso genico pervasivo e discordanze cito-nucleari32, inducendo così sostanziali difficoltà nel recuperare segnali chiari della struttura della popolazione dai loci usati tradizionalmente.A questo proposito, M. schreibersii è un viaggiatore a lunga distanza33 che conduce migrazioni stagionali fisse tra hibernacula, nidi di maternità e siti di accoppiamento con spostamenti di 40-100 km in media, ma fino a diverse centinaia di chilometri34,35.Tuttavia, la dispersione di giovani o adulti nel complesso rimane rara in questa specie, quindi si è sostenuto che i movimenti regionali piuttosto che a lunga distanza contribuiscano alla maggior parte degli scambi genetici36.Di conseguenza, la composizione dei siti di svernamento e di svernamento è risultata diversa37,38, quindi individui di origini indipendenti potrebbero condividere temporaneamente gli stessi siti.Nonostante i notevoli sforzi di campionamento e genotipizzazione, studi precedenti hanno riportato una struttura genetica ridotta nella vasta gamma della specie.Le analisi mitocondriali hanno trovato un singolo clade mitocondriale, con aplotipi strettamente correlati condivisi in tutto il bacino del Mediterraneo39, e le analisi dei microsatelliti non hanno rilevato modelli geografici significativi di differenziazione nucleare40.Entrambi i risultati sono stati interpretati come la conseguenza della storia biogeografica della specie, vale a dire la massiccia ricolonizzazione dell'Europa dopo l'ultima era glaciale da un unico refugium, presumibilmente in Anatolia39,40.Sebbene questa ipotesi abbia valore, una tale forte omogeneità genetica su scala continentale può ugualmente riflettere la mancanza di informatività dei marcatori genetici convenzionali per rilevare livelli superficiali di differenziazione della popolazione, ad esempio, se la struttura del rifugio fosse stata compromessa da alti livelli di gene post-glaciale flusso in questa specie mobile.Allo stesso modo, questi possono trascurare sottili segnali genetici causati dall'organizzazione sociale della specie.Anche una conoscenza precisa della diversità genetica e della struttura genetica sarebbe importante per guidare la pianificazione della conservazione.Nonostante la sua ampia distribuzione, M. schreibersii sta affrontando un drammatico declino in Europa a partire dalla metà del XX secolo, essendo stato addirittura estirpato da diversi paesi negli ultimi anni, al punto che è attualmente considerato Vulnerabile dalla Lista Rossa IUCN (VU A2c)41 .In che modo la storia biogeografica, l'organizzazione sociale e il recente declino abbiano interagito con la filopatria, la dispersione regionale e la migrazione a lunga distanza per modellare la struttura genetica di M. schreibersii rimane quindi una questione aperta, soprattutto data la (mancanza di) modelli geografici recuperati da studi precedenti.Le analisi genomiche sarebbero quindi tempestive e, a loro volta, offrirebbero l'opportunità di valutare la risoluzione molecolare necessaria per rilevare la struttura genetica quando ce n'è poca.A tal fine, qui abbiamo analizzato insiemi regionali di popolazione e singoli campioni nelle gamme dell'Europa occidentale e centrale di M. schreibersii con loci microsatelliti e SNP ottenuti da ddRAD-seq.I risultati di entrambi gli approcci sono stati confrontati direttamente mediante misure quantitative (indici di fissazione, eterozigosi, differenziazione a coppie) e qualitative (assegnazione di cluster).Mentre ci si aspetta generalmente che RAD-seq fornisca stime più accurate, dovrebbe essere particolarmente più informativo rispetto ai microsatelliti per rilevare la struttura filogeografica e regionale, anche se le popolazioni si scambiano frequentemente geni e individui migratori.Un totale di 196 individui adulti di M. schreibersii sono stati campionati da 19 località che coprono sette regioni europee durante la primavera e l'estate 2010, 2011 e 2012 (Tabella 1).I pipistrelli sono stati catturati da reti antinebbia o trappole ad arpa all'ingresso delle caverne appollaiate, sia all'emergenza che entrando nel posatoio durante il giorno.Per ogni individuo, il sangue è stato prelevato perforando la vena uropatagiale con un ago da 0,5 mm (Neolus ®).Sono stati raccolti volumi di 10-30 μl con capillari eparinizzati (Assistent ®), spalmati su carta da filtro e asciugati in una busta per la conservazione sul campo a temperatura ambiente.Sulla ferita è stato applicato un cotone omeostatico fino a quando l'emorragia non si è fermata.Inoltre, sulla membrana dell'ala (Stiefel ®) è stato applicato un punch per biopsia di 1 mm di Ø e il tessuto è stato conservato in etanolo al 96%.I pipistrelli sono stati rilasciati immediatamente nel luogo della cattura.Tutti i protocolli sperimentali (cattura di animali e campionamento di tessuti) sono stati approvati dai comitati competenti, vale a dire il Service Vétérinaire du Canton de Vaud per la Svizzera (2322), il Ministero dell'Ambiente della Repubblica slovacca per la Slovacchia (2598/715/03-5.1 pil) , il Departament d'Agricultura, Ramaderia, Pesca, Alimentació i Medi Natural de la Generalitat de Catalunya per la Spagna (SF/379), la Direzione per la Protezione della Natura del Ministero della Cultura per la Croazia (URBROJ 532-08-01-04/ 3-10-02), il Ministro dell'Ambiente per l'Italia (7588), il DREAL della (ex) regione Aquitania per la Francia, e l'Instituto para a Conservação da Natureza e Biodiversidade per il Portogallo.Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti.Il DNA è stato estratto utilizzando il kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen ®) seguendo le istruzioni del produttore ad eccezione delle seguenti particolarità.Frammenti di carta imbevuti di sangue (~ 10 mm di diametro) sono stati tagliati in piccoli pezzi con forbici sterili e incubati in 360 µL di tampone ATL a 90 °C per 15 min.Dopo il raffreddamento, a ciascun campione sono stati aggiunti 40 µL di proteinasi K e lasciati per la digestione notturna a 56 °C.L'eluizione è stata eseguita in volumi di 55 µL e incubando 15 minuti a 37 °C prima della centrifugazione.Questo passaggio è stato ripetuto una seconda volta per massimizzare i rendimenti del DNA.Per un sottogruppo di individui, è stato estratto ulteriore DNA dalla biopsia dell'ala dopo aver risciacquato i tessuti conservati con etanolo mediante immersione in pura acqua MilliQ (Millipore®).Gli individui sono stati genotipizzati in 11 loci microsatelliti polimorfici amplificati in quattro multiplex PCR42,43.Loci, primer e protocolli di amplificazione sono dettagliati in44.Gli ampliconi sono stati sottoposti a controllo di qualità su un gel di agarosio, tipizzati su un analizzatore genetico ABI Prism 3100 (Applied Biosystems ®) e misurati con GeneMapper (Applied Biosystems).Infine, abbiamo verificato la presenza di grandi drop out allelici, balbuzie e alleli nulli utilizzando Micro-Checker v2.2.345.Per la preparazione della libreria genomica, i campioni estratti sono stati prima concentrati utilizzando una precipitazione di cloropano.Abbiamo quindi preparato una libreria ddRAD modificata da46, come dettagliato nel file supplementare S1.Tre librerie separate sono state multiplexate e sequenziate su due corsie di un Illumina HiSeq2000 (Lausanne Genomic Technologies Facility, Svizzera).Le sequenze con un basso rapporto segnale-rumore (<0,6) sono state scartate utilizzando il filtro Chastity di Illumina.In assenza di un genoma di riferimento, il demultiplexing, l'impilamento e la catalogazione delle letture è stato eseguito con la pipeline de-novo di STACKS 0.99647.Le sequenze monomorfiche e di bassa qualità (punteggio Phred inferiore a 10 in media su finestre scorrevoli di 15 bp) sono state filtrate, con una copertura minima di tre e impilamento fino al 3% di divergenza tra le letture.Gli script R personalizzati sono stati sviluppati per filtri aggiuntivi e chiamate SNP.Innanzitutto, i loci con più di cinque SNP sono stati scartati nel tentativo di escludere elementi ripetitivi ed è stata applicata una soglia di otto letture per genotipo.In secondo luogo, non sono stati considerati i genotipi tri-allelici, gli eterozigoti con un allele raro rappresentato da meno del 25% delle letture e singleton.In terzo luogo, gli SNP sono stati definiti genotipizzati se sequenziati in almeno il 70% degli individui.Infine, per escludere evidenti valori anomali, gli SNP con un FIS48 al di fuori dell'intervallo di -0,2 e 0,2 sono stati rimossi con hierfstat49, poiché non sono previsti deficit eterozigoti estremi in una specie diploide con sessi separati.La struttura genetica e la diversità dei set di dati microsatellite e RAD-seq sono state studiate a livello di popolazione utilizzando hierfstat49 da parametri genetici di popolazione standard50.Innanzitutto, abbiamo calcolato l'eterozigosi osservata (HO), l'eterozigosi attesa (HS, nota anche come diversità genica), l'eterozigosi complessiva sulle popolazioni (h T), la ricchezza allelica (a R), l'FST specifico della popolazione (Beta51) e la partenza da Hardy-Weinberg (FIS).Gli intervalli di confidenza (IC) al 95% per le eterozigosi e le statistiche F48 sono stati stimati eseguendo il bootstrap di 1000 volte i componenti della varianza.Le correlazioni di Pearson sono state utilizzate per confrontare le stime tra set di marcatori e per valutare l'influenza dei dati mancanti sulle stime RAD-seq.Per identificare qualsiasi locus anomalo, abbiamo ulteriormente studiato la relazione tra le frequenze alleliche e l'eterozigosi osservata per entrambi i set di marcatori tracciando HS e i loro intervalli di confidenza al 95% data la frequenza allelica e il deficit globale di eterozigote, calcolato come HS = 2p (1 - p) (1 − f IT) ± 2[(2p(1 − p)(1 + f IT)/N]0.5.In secondo luogo, l'FST a coppie tra le popolazioni48 è stato stimato e confrontato tra set di marcatori mediante test Mantel52, quindi utilizzato per testare l'isolamento per distanza (IBD53).Sono state calcolate le distanze delle corde54 (funzione genet.dist di hierfstat), tradotte in un albero di giunzione dei vicini (funzione bionj di ape55).Inoltre, sono state effettuate analisi gerarchiche della varianza genetica per testare gli effetti di paesi e popolazioni.A tal fine, l'FST è stato suddiviso tra le popolazioni, all'interno del paese (FSC) e tra i paesi (FCT).In terzo luogo, abbiamo testato la dispersione basata sul sesso utilizzando l'indice mAIc implementato in hierfstat (sexbias.test function56), che è stato confrontato tra i set di marcatori mediante una correlazione di Pearson.La struttura genetica tra i singoli genotipi è stata esaminata per la prima volta mediante analisi dei componenti principali (PCA) su ciascun set di marcatori, utilizzando la funzione indpca di hierfstat50.In secondo luogo, abbiamo applicato l'algoritmo di clustering snmf implementato in LEA57 per stimare in quanti cluster è possibile riepilogare il set di dati e calcolare le singole origini di ciascun individuo tra questi cluster.Per ogni set di marcatori, le catene sono state eseguite per K = 1–7 cluster, con 20 ripetizioni per ogni K e accecando il 10% dei dati per la stima dell'entropia incrociata (funzione snmf).Molto probabilmente i K sono riflessi da bassi valori di entropia incrociata.Il parametro alfa è stato mantenuto al valore predefinito 100 (come raccomandato dagli autori), soprattutto perché non ha influenzato i risultati nelle esecuzioni preliminari.Per apprezzare l'influenza dei dati mancanti sul set di dati RAD-seq, sono state eseguite anche esecuzioni su un set di dati ridotto basato solo su individui con oltre il 70% di completezza della matrice SNP (n = 172).Infine, abbiamo ulteriormente esplorato il modo in cui il numero di loci ha influenzato i modelli recuperati della struttura genetica ripetendo l'analisi della mescolanza su sottoinsiemi selezionati casualmente di 3.000, 2.000, 1.000, 500, 200 e 100 SNP.In questo studio, abbiamo ottenuto e confrontato i genotipi da 11 loci microsatelliti e 4.994 SNP ottenuti da RAD-seq per gli stessi 196 individui campionati su 19 popolazioni di M. schreibersii in sette paesi europei (Tabella 1).Le statistiche basate sulla popolazione (riassunte nella Tabella 1) hanno mostrato modelli di diversità e struttura per lo più coerenti.I loci microsatelliti erano più polimorfici degli SNP ottenuti da RAD-seq.I microsatelliti portano tra 3 e 18 alleli, un'eterozigosi HO media osservata di 0,537 (0,383-0,671), un'eterozigosi HS media attesa di 0,557 (0,395-0,694) e un'eterozigosi HT complessiva di 0,588 (0,418-0,734).Questi valori sono molto più grandi della diversità misurata agli SNP bi-allelici, con un HO medio di 0,122 (0,119–0,126), HS medio di 0,129 (0,125–0,133) e HT medio di 0,139 (0,134–0,143).La partenza dall'equilibrio di Hardy Weinberg si è sovrapposta tra i set di marcatori (SNP FIS = 0,053 [0,045–0,057]; microsatellite FIS = 0,035 [0,011–0,058]).La maggior parte degli SNP e degli alleli microsatelliti mostra una buona concordanza tra eterozigosi osservate e attese (Fig. 1).Per il set di dati RAD, HO e FIS erano sensibili alla completezza della matrice del genotipo SNP, come evidenziato da una minore eterozigosi e da una maggiore FIS nelle popolazioni con proporzioni più elevate di dati mancanti (File supplementare S2).Tuttavia, l'effetto è stato principalmente influenzato da una singola popolazione che presentava quasi il 50% dei dati mancanti (loc. 9, Francia) e non era significativo per HS (file supplementare S2).Relazione tra frequenza allelica ed eterozigosi osservata per ciascun microsatellite (blu) e allele SNP (rosso).La linea nera continua corrisponde all'eterozigosi prevista HS = 2p(1 − p)(1 − f IT) e le linee tratteggiate all'intervallo di confidenza al 95% di HS.Le stime di microsatellite e RAD-seq erano significativamente correlate per HS (r = 0,62; P = 0,004) e FST specifico della popolazione (r = 0,63; P = 0,004) (Fig. 2).La correlazione era grande anche per ar (r = 0,68; P = 0,001), come previsto poiché ar co-varia con hs .Al contrario, le relazioni non erano significative per f is e ho (Fig. 2).Correlazione tra stime genetiche della popolazione misurate da microsatelliti e SNP ottenute da RAD-seq.HO: eterozigosi osservata;HS: eterozigosi prevista;FIS: coefficiente di consanguineità;Beta: FST specifico della popolazione.Vengono visualizzati i coefficienti di correlazione di Pearson (r) ei valori P associati.La differenziazione della popolazione a coppie (f st ) era più forte se stimata dagli SNP (media FST = 0,068 [0,065-0,071]) che dai microsatelliti (media FST = 0,053 [0,041-0,066]).C'era una correlazione significativa tra le stime FST basate su microsatelliti e SNP (test Mantel, Fig. 3), ma un modello significativo di isolamento per distanza è stato recuperato solo dal set di dati SNP (test Mantel, Fig. 3).Inoltre, entrambi i set di f st hanno prodotto alberi simili basati sulle distanze Chord, dove le popolazioni sono per lo più raggruppate per paesi (Fig. 4).Correlazione tra FST a coppie calcolata da SNP RAD-seq e microsatelliti e con distanze geografiche.Vengono visualizzati il ​​coefficiente dei test di Mantel (r) ei valori P associati.(A) Analisi dei componenti principali (PCA) dei singoli genotipi e (B) albero di giunzione vicina delle distanze di corda, come dedotto dai microsatelliti e dagli SNP RAD-seq.La mappa in basso mostra le posizioni di campionamento (numeri come nella Tabella 1) con codici colore per distinguere le popolazioni in base ai paesi.Lo sfondo grigio mostra la distribuzione della specie, secondo41.Di conseguenza, le analisi della varianza genetica hanno rivelato una differenziazione più forte tra i paesi (f ct ) che tra le sottopopolazioni all'interno dei paesi (f sc ), specialmente se stimata dagli SNP: per i microsatelliti, f sc era 0,023 (0,013-0,034) e f ct era 0,035 (0,026-0,043), mentre per gli SNP, f sc era 0,019 (0,017-0,020) e f ct era 0,058 (0,056-0,061).Entrambi i set di dati non hanno mostrato prove di dispersione basata sul sesso (microsatelliti: t = - 0,91, P = 0,37; SNP: t = - 0,62, P = 0,53).Il mAIc corretto per microsatelliti e SNP è fortemente correlato (r = 0,49, P <0,001).Contrariamente alle analisi a livello di popolazione per lo più congruenti, il set di dati SNP ha fornito una risoluzione molto più elevata rispetto ai microsatelliti nelle analisi basate sull'individuo.Il microsatellite PCA non ha mostrato chiari schemi di struttura, poiché individui di varia origine si sovrappongono sui primi assi.Al contrario, gli assi 1 e 2 del PCA costruiti dai genotipi SNP hanno ordinato la maggior parte degli individui in base al paese di origine (Fig. 4).Di conseguenza, le analisi di clustering dell'algoritmo snmf hanno mostrato modelli radicalmente diversi di struttura genetica (Fig. 5).Con i microsatelliti, l'entropia incrociata difficilmente evidenziava un numero particolare di ammassi.Con gli SNP, mostra chiaramente che sono necessari almeno quattro cluster per spiegare la struttura presente nel set di dati.Come i PCA, i coefficienti di ascendenza dei microsatelliti non trasmettevano un modello geografico significativo mentre gli individui venivano assegnati in base alle loro popolazioni di origine e al paese in base agli SNP (Fig. 5).Analisi di mescolanza sui dati dei microsatelliti (a sinistra) e degli SNP RAD-seq (a destra).(A) Coefficienti di ascendenza individuale per K = 2–7.(B) Boxplot di entropia incrociata per ogni K.Le analisi di mescolanza condotte su sottoinsiemi di SNP hanno recuperato il segnale "vero" della struttura genetica (come ottenuto dal set di dati completo), a seconda del numero di marcatori conservati e della complessità dello schema di raggruppamento (numero di gruppi K) (Fig. 6) .Con set di dati di grandi dimensioni (≥ 500-1000 SNP), si ottengono risultati sostanzialmente simili, anche per la stima degli antenati tra molti gruppi.L'immagine diventa sfocata con solo 200 SNP (soprattutto per valori più alti di K) e l'entropia incrociata suggerisce che nel set di dati esistono principalmente due gruppi.Infine, l'analisi con solo 100 SNP era essenzialmente non informativa.Analisi di mescolanza su sottoinsiemi di dati SNP.I modelli globali di struttura (quattro cluster principali in blu, verde, arancione e rosso) tendono a svanire al di sotto di 500 SNP e sono necessari 1000 SNP per recuperare correttamente la sottostruttura regionale (cluster giallo, viola e rosa).Nonostante la differenziazione genetica complessivamente bassa (vedi sopra), il set di dati SNP ha recuperato chiari modelli di struttura genetica nell'intervallo campionato di M. schreibersii (Figg. 4, 5, 6, 7).Nello specifico, i quattro cluster principali identificati dall'analisi snmf preferita distinguevano approssimativamente i pipistrelli dal Portogallo (loc. 1–4; blu in Fig. 7);Spagna nordoccidentale (loc. 5–8; verde in Fig. 7);Italia (loc. 11–13; arancione in Fig. 7);e Croazia (loc. 14–17; rosso nella Fig. 7).Gli individui delle altre popolazioni mostravano ascendenze provenienti da diversi cluster (Fig. 7), e di conseguenza erano collocati in posizioni intermedie sui primi due assi del PCA (Fig. 4): quelli della Francia (loc. 9) e della Svizzera (loc. 10) sono per lo più “spagnoli”, con contributi sostanziali da tutti gli altri cluster;gli individui di una popolazione italiana (loc. 12) hanno mostrato pari contributi dai cluster “Italiano” e “Croato”;gli individui delle due popolazioni slovacche sono per lo più “croati”, con contributi sostanziali del cluster “italiano” e “spagnolo”.Analisi separate limitate a 172 individui con meno del 30% di dati mancanti hanno recuperato risultati quasi identici (File supplementare S3).Panoramica della struttura genetica e della diversità di M. schreibersii in Europa, come dedotto dal set di dati SNP.(A) Analisi di clustering basate sulla soluzione snmf preferita di quattro gruppi (mappa principale e grafici a barre superiori) e basate sulla soluzione dei sette gruppi, che identificano demi distinti all'interno di diverse regioni (grafici a barre inferiori).(B-D) Proporzioni all'interno delle popolazioni di individui assegnati prevalentemente a entrambi i demi regionali.(E) Variazione geografica di h S, da 0,11 (bianco) a 0,14 (rosso).Nella mappa principale, lo sfondo grigio mostra la distribuzione delle specie, secondo40.Credito fotografico: PC.Ispezioni dettagliate delle corse di mescolanza con un massimo di sette gruppi hanno rivelato una notevole sottostruttura tra i principali cluster portoghesi, italiani e croati che consentono di tracciare i movimenti individuali a livello regionale.In Portogallo i pipistrelli catturati in loc.3 e 4 differiscono geneticamente (cluster blu e giallo in Fig. 7) e individui puri di entrambi i sottocluster sono stati trovati in sintopia in loc.1 e 2. In Italia, loc.12 individui sono stati identificati come un diverso sottocluster (rosa in Fig. 7), ad eccezione di due che sembrano originati dal principale gruppo italiano rinvenuto in loc.11 e 13 (arancione in Fig. 7).In Croazia, loc.17 rappresenta una popolazione distinta (viola in Fig. 7), ma loc.14–16 ospitano anche alcuni dei suoi individui.Questi modelli sono confermati dall'ispezione di ulteriori assi PCA (File supplementare S4).La diversità genetica (HS, che non è stata influenzata dai dati mancanti), variava notevolmente tra le popolazioni, essendo generalmente più elevata in Portogallo, Spagna nordoccidentale e Croazia (Fig. 7).Ci si aspetta che i vertebrati volanti presentino una differenziazione genetica superficiale tra le popolazioni a causa delle loro elevate capacità di movimento58,59, ma allo stesso tempo, possono sorgere modelli complessi di sottostruttura regionale tipicamente a causa di comportamenti filopatrici e migratori31, combinati con la storia biogeografica delle popolazioni.Rispetto a questi aspetti, qui abbiamo mirato a stimare la struttura genetica nel pipistrello mobile, migratore e presuntamente filopatrico M. schreibersii in tutta Europa, confrontando approcci basati su pochi loci altamente polimorfici (microsatelliti) vs molti loci bi-allelici (SNP ottenuti da RAD -seq).Entrambi i set di marcatori hanno recuperato stime f ST basse nell'intervallo europeo di M. schreibersii, vale a dire 0,05 (microsatelliti) o 0,07 (SNP) in media.Ciò è in accordo con la precedente genotipizzazione dei microsatelliti che ha trovato poca differenziazione genetica nell'intervallo delle specie40, così come il fatto che un unico lignaggio mitocondriale abita l'Europa39.Come hanno concluso questi studi, la mancanza di divergenza filogenetica tra popolazioni separate da migliaia di chilometri e il marcato isolamento per distanza suggeriscono un'elevata connettività.A differenza degli studi precedenti, tuttavia, abbiamo recuperato la struttura genetica in tutta Europa con SNP a livello di genoma.Abbiamo anche riscontrato livelli simili di diversità tra le popolazioni, in particolare tra quelle più orientali e quelle più occidentali (Portogallo e Croazia).Entrambi i risultati sono in qualche modo sorprendenti se si presume che la specie si sia espansa post-glaciale in tutta Europa da un unico refugium anatolico, lo scenario biogeografico attualmente accettato, basato su una maggiore diversità mitocondriale e microsatellite in Anatolia39,40.In questo scenario, ci si sarebbe aspettati un singolo cluster genetico e un gradiente longitudinale di variazione genetica verso ovest in tutto il continente (vale a dire, una minore diversità in Iberia rispetto ai Balcani).Se le gamme glaciali di M. schreibersii comprendessero anche l'Europa mediterranea, oltre all'Anatolia, rimane quindi una questione aperta.Infatti, la struttura che abbiamo individuato in Europa sarebbe addirittura coerente con distinti rifugi storici nella penisola iberica, appenninica e balcanica, forse suddivisi in microrifugi (es. Iberia).A questo proposito, l'enigmatica ascendenza dei pipistrelli slovacchi potrebbe riflettere una recente mescolanza tra il gruppo croato e un pool genetico che non abbiamo campionato, ad esempio da un altro refugium separato, ad esempio l'Anatolia.Le ultime righe sulla biogeografia di M. schreibersii sono quindi ancora da scrivere.Un'indagine genomica che comprenda popolazioni sia europee che extraeuropee per dedurre in modo completo i modelli di diversità, struttura e mescolanza genetica a livello di gamma, forse combinata con la ricostruzione di nicchie ambientali per tracciare gli habitat adatti alla specie durante l'ultimo massimo glaciale, sarà la chiave per districarsi tra l'ipotesi di un refugium vs diverse ipotesi di refugia.Habitat glaciali adatti sono stati modellati nell'Europa meridionale per altre specie di pipistrelli con distribuzioni approssimativamente simili, ad esempio Nyctalus leisleri60 o Plecotus austriacus61.Come M. schreibersii, i pipistrelli europei in generale mostrano una struttura filogeografica ridotta60,62,63, o talvolta un recente isolamento geografico derivante dall'ultimo stadio glaciale, come in Rhinolophus ferrumequinum64 e Rhinolophus hipposideros65.Tuttavia, la mancanza di una chiara struttura genetica tra le regioni candidate al rifugio non implica necessariamente un unico scenario di rifugio, come qui ipotizzato in precedenza per M. schreibersii39,40, così come in altre specie, ad esempio Myotis bechsteinii66.Negli organismi mobili, i segnali genetici per più rifugi (ad esempio, diversi lignaggi glaciali) possono rapidamente scomparire in caso di flusso genico e fusione di lignaggio67, e diventare non rilevabili con pochi loci microsatelliti ereditati biparentalmente.Segnali di lunga durata possono persistere nei mitocondri, ma solo se le femmine sono più filopatriche dei maschi.In modo simile, esistono rifugi multipli nel barbagianni europeo (Tyto alba), un uccello a dispersione rapida con una distribuzione circum-mediterranea simile, ma allo stesso modo è stato recuperato solo da dati genomici, vale a dire il sequenziamento dell'intero genoma59, e non microsatelliti68 .I paradigmi biogeografici classici caratteristici dei vertebrati terrestri, come la persistenza a lungo termine in rifugi mediterranei separati69,70 e la loro differenziazione regionale in rifugi all'interno di rifugi71 potrebbero quindi applicarsi a pipistrelli e uccelli anche se gli studi sui microsatelliti hanno finora suggerito il contrario.Detto questo, alcune specie di pipistrelli olartici diffusi potrebbero essere davvero geneticamente omogenee.Ad esempio, il Myotis lucifugus nordamericano manca di differenziazione della popolazione, misurata da marcatori convenzionali (microsatelliti + mtDNA72) e genomici (RAD-seq73; genoma a bassa copertura74).Mol.Mol.J.Appl.Nat.Mol.Mol.Mol.Mol.Davanti.Sci.Mol.Mol.Mol.Mol.Mol.Mol.Mol.Mol.Mol.Sci.Mol.Mol.Mol.Mol.Sci.Mol.Sci.Nat.Mol.Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.Chiunque con cui condividi il seguente link sarà in grado di leggere questo contenuto:Fornito dall'iniziativa di condivisione dei contenuti Springer Nature SharedIt